Дифференциально диагностические среды. Дифференциально – диагностические среды: перечислить основные виды, принципиальный состав, назначение и использование в практике. Профаг – это

Для выделения чистых культур применяют оптимальные питательные среды с фиксированным рН. Большинство б! способны расти на разл пит средах, за исключением хламидий и риккетсий, к/е не растут вне ##.

ДДС – используются для изучения и идентификации отдельных групп, видов, типов б!! В их основе различные органические и неорг в-ва, при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки, мочевина…) сторону. В эти среды часто вносят разл индикаторы, позволяющих визуально оценить изменение рН. Напр, сдвиг в КИСЛУЮ сторону вызывает покраснение индикатора Андреде (в основе фуксин) или пожелтение при использовании бромтимолового синего , а при сдвиге в ЩЕЛОЧНУЮ сторону они не меняют окраски.

ДДС Эндо, Левина, Плоскирева прм для диагностики кишечных заболеваний (шигеллёзов, сальмонеллёзов). Готовятся они в чашках Петри, в основе МПА + лактоза (ферментируется только E.coli, но не патогенными мкÒ) + индикатор.

ЭНДО . Индикатор по типу индикатора Андреде, лучше держать в тёмном месте. Растущая колония E.coli вырабатывает конечные продукты → окраска красная, часто с металлическим блеском; Shigella и Salmonella → бесцветные колонии.

ЛЕВИНА . Индикатор – эозин-метилениовая синь, при рН³7 имеет цыет эозина (розовый), в кислой среде – восстанавливается метиленовый синий (цвет тёмно-синий). Колнии E.coli → окраска тёмно-синяя, Shigella и Salmonella → бесцветные колонии (под цвет среды).

ПЛОСКИРЕВА . Индикатор – нейтральный красный; рН=7 бесцветный (патогенный б!), рН<7 розово-красный (E.coli). И ещё присутствуют 2 добавки: бриллиантовый зелёный и соли жёлчных кислот. На т/й среде угнетается рост воздушной мкФ, к тому же на ней не растут многие (но не все) штаммы E.coli.

РЕССЕЛЯ . Эта среда комбинированная, готовится в пробирке, половина –скошенная часть, другая – столбик. В среду входят МПА (среда полужидкая), лактоза (1%), глюкоза (0,1%), индикаторы (розоловая к-та и водно-голубой ). При рН=7 среда окрашивается в розовый цвет (за счёт розоловой к-ты), рН<7 – в синий. Иногда добавляют бром-тимоловый синий , рН=7 – сине-зеленовытый, рН<7 – бесцветный. Рассев производят по поверхности скошенной части и уколом в глубину столбика. E.coli → среда обсцвечивается и появляются пузыри газа, Shigella и Salmonella → цв изм-ся только в столбике, а скошенная часть останется без изменений, т.к. наилучшие условия для ферментации глюкозы – анаэробные, наиболее активно она будет распадаться в столбике, образуя кисл продукты, газа не будет. У Salmonella paratyphi → то же плюс газ.

Также с Д-Д целью используют другие ферментативные свойства. Напр, «пёстрый» (цветной) РЯД ГИССА – пептонная вода и различные углеводы + индикатор (Андреде = кислый фуксин + щёлочь) и стеклянный поплавок для улавливания газа. Из углеводов наиболее часто применяют МС (глюкоза, ксилоза, арабиноза, фруктоза, манноза, галактоза), ДС (сахароза, мальтоза, лактоза), ПС (крахмал, гликоген, инулин, декстрин) и гликозиды. Среды засевают, и если мкÒ имеет соответствующий фермент, то образуются кислоты, они восстанавливают фуксин и среда приобретает красный цвет. Если при окислении углеводов выделяется СО 2 , то он скапливается в поплавке. Белки расщепляются протеолитическими ферментами до АК, а они в свою очередь распадаются до простых соед-й (СО 2 , NН 3 и др). На практике для определения этих ферментов опред-ют индол (+щавелевая кислота → краснеет) и сероводород (H 2 S) (+ уксусно-кислый Pb → чернеет).

Л актоза Г люкоза М аннит М альтоза С ахароза И ндол H 2 S

E.coli К+Г+ К+Г+ К+Г+ К+Г+ К–Г– + –

S. typhi К–Г– К+Г– К+Г– К+Г– К–Г– – +

S. paratyphi А К–Г– К+Г+ К+Г+ К+Г+ К–Г– – –

S. paratyphi В К–Г– К+Г+ К+Г+ К+Г+ К–Г– – +

Также определяют наличие ПЛАЗМОКОАГУЛАЗЫ (по свёртыванию плазмы крови), ГИАЛУРОНИДАЗЫ (по р-рению сгустка гиалуроновой кислоты в пробирке в жидкой среде), ЛЕЦИТИНАЗЫ (лецитин входит в состав # стенок, при добавлении в среду и его разрушении – ЖСА – скапливаются продукты обмена Þ помутнение; этот фермент есть у Staphylococcus aureus, а у St. epidermidis – нет).

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева . Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска). Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2. Среды с крахмалом используют для выявления микроорганизмов, образующих амилазу. Наличие фермента определяется при добавлении к культуре несколько капель раствора Люголя

(цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3. Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (идентификации микроорганизмов по сахаролитической и протеолитической активности).

2.1. Среды Гисса с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, арабиноза и другие) в которых выявляют ферментативную активности микроорганизмов.Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Соломенно-желтого цвета среда при положительной реакции меняет цвет на красный или интенсивно розовый, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее цвета. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

Состав: пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде (фуксин)- 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

2.2. Среды для изучения протеолитических свойств

Среды с желатином . В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитические ферменты выявля­ются путем разжижения желатины.

Среды с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

Среды с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

2.3. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.4. Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера . Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na 2 S0 3 , хлорид железо FeCl 2 . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na 2 S0 3 в Na 2 S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.

к работе № 2

Микроорганизмам, как всему живому, присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение.

Основные понятия темы:

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки.

Колония - это потомство микробов, выросших из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Чистая культура – популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Индикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода)

Идентификация – определение вида, типа, биовара, серовара, фаговара выделенной чистой культуры.

к работе № 3

Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион); факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка); анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены). При культивировании облигатных анаэробов требуется создание особых условий анаэробиоза . При этом используют особые приборы и среды (анаэростат, эксикатор, среды тиогликолиевая, Вильсона-Блера).

дифференциально-диагностические среды, специальные питательные среды, используемые для идентификации микроорганизмов, обладающих избирательной биохимической активностью по отношению к определённым веществам. В процессе развития микробы с помощью ферментов расщепляют входящие в состав среды определённые вещества, что устанавливают по изменению среды.

Ряд патогенных микроорганизмов разлагают углеводы, многоатомные спирты с образованием кислот и газов (углекислоты, водорода, метана), что указывает на принадлежность их к определённой группе или виду бактерий. Для установления этих свойств готовят жидкие или полужидкие Д.-д. с. с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннозой и др. углеводами, многоатомными спиртами (пёстрый ряд), с индикаторами (Андраде, Гисса), среды с молоком. Ферментативную способность микробов определяют по появлению газа или изменению цвета индикатора. Интенсивность кислотообразования из глюкозы определяют на среде Кларка, образования ацетилметилкарбонала - с помощью реакции Фогеса‑Проскауэра, амилолитическую способность микробов - на крахмальном агаре. Протеолитические свойства микробов определяют на средах, не содержащих глюкозу и глицерин, - мясо-пептонном желатине, свернувшейся лошадиной сыворотке, молочном агаре. Мясо-пептонный желатин засевают путём укола до дна пробирки, инкубируют при t 20-22{{°}}C, а затем определяют степень разжижения желатина. Гемолитическую способность микробов устанавливают путём высева на кровяной агар или бульон с кровью. Для определения редуцирующей активности микробов применяют Д.-д. с. с красителями (метиленовый синий, лакмус, индидокармин, тионин и др.). По мере роста микробов происходит полное или частичное обесцвечивание или изменение цвета красителя. Используют также среды с нитратами, в которых под воздействием ферментов определенных микробов нитраты восстанавливаются в нитриты и далее - в аммиак или свободный азот.

Существуют специальные селективные среды для выращивания анаэробов (Китта-Тароцци среда и др.), идентификации некоторых бактерий кишечной группы, сальмонелл (среды Эндо, Левина, Симмонса, Плоскирева и др.), для определения подвижности микробов, их отношения к кислороду (среда Пешкова) и др. Возбудителя туберкулёза выращивают на специальных яичных средах Петраньяни, Ливенштейна-Йенсена, Гельберга, возбудителей паратуберкулёза - на среде Дюбо-Смита, бруцеллёза - на средах Альбини, Вейбриджа, Корнеевой; возбудителя вибриоза - на среде ГНКИ. Микоплазмы наиболее успешно выделяются и поддерживаются на среде Эдварда и др. специальных средах; лептоспиры - на сывороточных средах Терских, Уленхута, Любашенко, альбуминовой среде ГНКИ. Возбудитель копытной гнили овец растет на мозговых средах с добавлением экстракта копытного рога и серусодержащих аминокислот; грибы - на средах Саоуро, Чапека и др.

Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав ДДС входят:

1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов

2. Определенный углевод - лактоза

3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.

ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.

Элективные питательные среды

Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона - в щелочной среде.

Разлив сред

1. Агаровых сред в чашки Петри:

а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА

б) поставить чашку крышкой вверх

в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня

г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью

д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку

е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.

Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.

2. Агаровых среда в пробирки:

а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой

б) левой рукой взять пробирку

в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью

г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды

д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками

Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:

1. Скошенного столбика

2. Комбинированного столбика

3. Столбика

Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Мясо-пептонный агар

Среда Эндо . К 100 мл нейтрального расплавлен­ного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекисло­го натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в те­чение10 мин при температуре 100° С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следую­щим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спир­тового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний прини­мает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса . Для изготовления индикатораАндредэ берут 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдержи­вают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.

Среду с индикатором Андредэ приготовляют следую­щим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0-7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% - 1% (лак­тозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета обра­зования газа бродильными трубочками. Вместо трубо­чек иногда помещают кусочки ваты - 0,02 г на пробир­ку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера . В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерили­зуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Определение рН питательных сред

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0-7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной прак­тике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Контрольные вопросы :

Состав питательных сред.

Как культивируют в лабораторных условиях микроорганизмы?

Какие бывают питательные среды по консистенции?

Как различают питательные среды по происхождению?

Плотные питательные среды и их характеристика.

Сухие питательные среды и их характеристика.

Углеводные питательные среды, их характеристика.

Автоклавирование.

Стерилизация текучим паром.

Пастеризация.

Стерилизация фильтрованием.

Как готовят МПБ, МПЖ, МПА?