Мембранный транспорт. Пассивный транспорт веществ через мембрану: описание, особенности Мембранный транспорт

Транспорт веществ внутрь и наружу клетки, а также между цитоплазмой и различными субклеточными органеллами (митохондриями, ядром и т.д.) обеспечивается мембранами. Если бы мембраны были глухим барьером, то внутриклеточное пространство оказалось бы недоступным для питательных веществ, а продукты жизнедеятельности не могли бы быть удалены из клетки. В то же время при полной проницаемости было бы невозможно накопление определенных веществ в клетке. Транспортные свойства мембраны характеризуются полупроницаемостью : некоторые соединения могут проникать через нее, а другие - нет:

Проницаемость мембран для различных веществ

Одна из главных функций мембран - регуляция переноса веществ. Существуют два способа переноса веществ через мембрану: пассивный и активный транспорт:

Транспорт веществ через мембраны

Пассивный транспорт . Если вещество движется через мембрану из области с высокой концентрацией в сторону низкой концентрации (т.е. по градиенту концентрации этого вещества) без затраты клеткой энергии, то такой транспорт называется пассивным, или диффузией . Различают два типа диффузии: простую и облегченную .

Простая диффузия характерна для небольших нейтральных молекул (H2O, CO2, O2), а также гидрофобных низкомолекулярных органических веществ. Эти молекулы могут проходить без какого-либо взаимодействия с мембранными белками через поры или каналы мембраны до тех пор, пока будет сохраняться градиент концентрации.

Облегченная диффузия . Характерна для гидрофильных молекул, которые переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных мембранных белков - переносчиков. Для облегченной диффузии, в отличие от простой, характерна высокая избирательность, так как белок переносчик имеет центр связывания комплементарный транспортируемому веществу, и перенос сопровождается конформационными изменениями белка. Один из возможных механизмов облегченной диффузии может быть следующим: транспортный белок (транслоказа ) связывает вещество, затем сближается с противоположной стороной мембраны, освобождает это вещество, принимает исходную конформацию и вновь готов выполнять транспортную функцию. Мало известно о том, как осуществляется передвижение самого белка. Другой возможный механизм переноса предполагает участие нескольких белков-переносчиков. В этом случае первоначально связанное соединение само переходит от одного белка к другому, последовательно связываясь то с одним, то с другим белком, пока не окажется на противоположной стороне мембраны.

Активный транспорт имеет место в том случае, когда перенос осуществляется против градиента концентрации. Такой перенос требует затраты энергии клеткой. Активный транспорт служит для накопления веществ внутри клетки. Источником энергии часто является АТР. Для активного транспорта кроме источника энергии необходимо участие мембранных белков. Одна из активных транспортных систем в клетке животных отвечает за перенос ионов Na+ и K+ через клеточную мембрану. Эта система называется Na+ - K+ - насос. Она отвечает за поддержание состава внутриклеточной среды, в которой концентрация К+ выше, чем Na+ :

Механизм действия Na+, K+-АТР-азы

Градиент концентрации калия и натрия поддерживается путем переноса К+ внутрь клетки, а Na+ наружу. Оба транспорта происходят против градиента концентрации. Такое распределение ионов определяет содержание воды в клетках, возбудимость нервных клеток и клеток мышц и другие свойства нормальных клеток. Na+ ,K+ -насос представляет собой белок - транспортную АТР-азу . Молекула этого фермента является олигомером и пронизывает мембрану. За полный цикл работы насоса из клетки в межклеточное вещество переносится три иона Na+, а в обратном направлении - два иона К+. При этом используется энергия молекулы АТР. Существуют транспортные системы для переноса ионов кальция (Са2+ - АТР-азы), протонные насосы (Н+ - АТР-азы) и др. Симпорт это активный перенос вещества через мембрану, осуществляемый за счет энергии градиента концентрации другого вещества. Транспортная АТР-аза в этом случае имеет центры связывания для обоих веществ. Антипорт - это перемещение вещества против градиента своей концентрации. При этом другое вещество движется в противоположном направлении по градиенту своей концентрации. Симпорт и антипорт могут происходить при всасывании аминокислот из кишечника и реабсорбции глюкозы из первичной мочи. При этом используется энергия градиента концентрации ионов Na+, создаваемого Na+, K+-АТР-азой.

К мембранным белкам относятся белки, которые встроены в клеточную мембрану или мембрану клеточной органеллы или ассоциированы с таковой. Около 25 % всех белков являются мембранными.

[показать]

Классификация[править | править вики-текст]

Мембранные белки могут быть классифицированы по топологическому или биохимическому принципу. Топологическая классификация основана на том, сколько раз белок пересекает липидный бислой. В соответсвии с этим критерием белки подразделяются намонотопические , битопические и политопические :

·монотопические белки взаимодействуют с одной поверхностью мембраны и не пересекаю её;

·битопические пронизывают мембрану насквозь и взаимодействуют с обеими её поверхностями;

·политопические пронизывают мембрану несколько раз (многократное взаимодействие с липидами).

Понятно, что первые относятся к периферическим белкам, а вторые и третьи к интегральным.

Различные категории политопических белков. Связывание с мембраной за счёт (1) единичной трансмембранной альфа-спирали, (2) множественных трансмембранных альфа-спиралей, (3) бета-складчатой структуры.

Различные категории интегральных монотопических белков. Связывание с мембраной за счёт (1) амфипатической альфа-спирали, параллельной плоскости мембраны, (2) гидрофобной петли, (3) ковалентно соединённогожирнокислотного остатка, (4) электростатического взаимодействия (прямого или кальций-опосредованного).

Топологическая классификация[править | править вики-текст]

По отношению к мембране мембранные белки делятся на поли- и монотопические.

·Политопические, или трансмембранные, белки полностью пронизывают мембрану и, таким образом, взаимодействуют с обеими сторонами липидного бислоя. Как правило, трансмембранный фрагмент белка является альфа-спиралью, состоящей из гидрофобных аминокислот (возможно от 1 до 20 таких фрагментов). Только у бактерий, а также вмитохондриях и хлоропластах трансмембранные фрагменты могут быть организованы как бета-складчатая структура(от 8 до 22 поворотов полипептидной цепи).

·Интегральные монотопические белки постоянно встроены в липидный бислой, но соединены с мембраной только на одной стороне, не проникая на противоположную сторону.

Биохимическая классификация[править | править вики-текст]

По биохимической классификации мембранные белки делятся на интегральные и периферические .

·Интегральные мембранные белки прочно встроены в мембрану и могут быть извлечены из липидного окружения только с помощью детергентов или неполярных растворителей. По отношению к липидному бислою интегральные белки могут быть трансмембранными политопическими или интегральными монотопическими.

·Периферические мембранные белки являются монотопическими белками. Они либо связаны слабыми связями с липидной мембраной, либо ассоциируют с интегральными белками за счёт гидрофобных, электростатических или других нековалентных сил. Таким образом, в отличие от интегральных белков они диссоциируют от мембраны при обработке соответствующим водным раствором (например, с низким или высоким pH, с высокой концентрацией соли или под действием хаотропного агента). Эта диссоциация не требует разрушения мембраны.

Мембранные белки могут быть встроены в мембрану за счёт жирнокислотных или пренильных остатков либогликозилфосфатидилинозитола, присоединённых к белку в процессе их посттрансляционной модификации.

7)Углеводная часть гликолипидов и гликопротеинов плазматической мембраны всегда находится на наружной поверхности мембраны, контактируя с межклеточным веществом. Углеводы плазматической мембраны выполняют роль специфических лигандов для белков. Они образуют участки узнавания, к которым присоединяются определенные белки; присоединившийся белок может изменить функциональное состояние клетки.

Функции углеводов.

В наружной мембране эритроцитов некоторые полисахариды содержат N-аце-тилнейраминовую кислоту на концах цепей. Если эритроциты выделить из крови, обработать in vitro нейраминидазой, отщепляющей N-ацетилнейраминовую кислоту от мембранных углеводов, и вновь ввести в кровь тому же животному, то обнаруживается, что время полужизни таких эритроцитов в крови уменьшается в несколько раз: они задерживаются в селезенке и разрушаются. Как выяснилось, в клетках селезенки есть рецептор, узнающий углевод, который утратил концевые остатки нейраминовой кислоты. Возможно, что такой механизм обеспечивает отбор селезенкой «состарившихся» эритроцитов и их разрушение.
Известно, что в суспензии клеток, выделенных из какой-либо ткани, через некоторое время образуются агрегаты клеток, причем в каждом агрегате, как правило, оказываются клетки одного типа. Например, в суспензии клеток, полученных из гаструлы, образуется три вида агрегатов: каждый из них содержит клетки, принадлежащие одному и тому же зародышевому листку - эктодерме, мезодерме или эндодерме. Узнавание между клетками обеспечивается, в частности, взаимодействием мембранных углеводов одной клетки с белками-рецепторами другой клетки (рис. 9.39). Эти механизмы узнавания могут участвовать в таких процессах, как гистогенез и морфогенез. Однако есть и другие механизмы, обеспечивающие межклеточные контакты.
Полисахариды клеточной мембраны наряду с белками выполняют роль антигенов при развитии клеточного иммунитета, в том числе при реакции отторжения трансплантата. Они также служат местами узнавания при заражении патогенными вирусами и микроорганизмами. Например, вирус гриппа при проникновении в клетку сначала присоединяется к ее мембране, взаимодействуя с полисахаридом определенной структуры.

8)леточные мембраны обладают избирательной проницаемостью: через них медленно диффундируют глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты, глицерол и ионы, причем сами мембраны в известной мере активно регулируют этот процесс - одни вещества пропускают, а другие нет. Существует четыре основных механизма для поступления веществ в клетку или вывода их из клетки наружу: диффузия, осмос, активный транспорт и экзо- или эндоцитоз. Два первых процесса носят пассивный характер, то есть не требуют затрат энергии; два последних - активные процессы, связанные с потреблением энергии.

Избирательная проницаемость мембраны при пассивном транспорте обусловлена специальными каналами - интегральными белками. Они пронизывают мембрану насквозь, образовывая своего рода проход. Для элементов K, Na и Cl есть свои каналы. Относительно градиента концентрации молекулы этих элементов движутся в клетку и из неё. При раздражении каналы натриевых ионов раскрываются, и происходит резкое поступление в клетку ионов натрия. При этом происходит дисбаланс мембранного потенциала. После чего мембранный потенциал восстанавливается. Каналы калия всегда открыты, через них в клетку медленно попадают ионы калия

ВВЕДЕНИЕ

Со времен Р. Вирхова известно, что живая клетка - это элементарная ячейка биологической организации, обеспечивающая все функции организма. Среди многообразных явлений, протекающих в клетке, важное место занимают активный и пассивный транспорт веществ, осмос, фильтрация и биоэлектрогенез. В настоящее время стало очевидно, что эти явления так или иначе определяются барьерными свойствами клеточных мембран. Клетка - открытая система, которая непрерывно обменивается с окружающей средой веществом и энергией. Во многих случаях биологического транспорта основой переноса веществ является их диффузия через клеточную или многоклеточную мембрану. Способы диффузионного переноса многообразны (рис. 1): диффузия жирорастворимых веществ через липидную часть мембраны, перенос гидрофильных веществ через поры, образуемые мембранными липидами и белками, облегченная диффузия с участием специальных молекул-переносчиков, избирательный транспорт ионов через ионные каналы. Однако в процессе эволюции живая клетка создала особый способ переноса, получивший название активного транспорта. В этом случае перенос вещества идет против перепада концентрации и поэтому сопряжен с использованием энергии, универсальным источником которой в клетке является молекула аденозинтрифосфорной кислоты.

ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

Живые системы на всех уровнях организации - открытые системы. Элементарная ячейка жизни - клетка и клеточные органеллы тоже открытые системы. Поэтому транспорт веществ через биологические мембраны - необходимое условие жизни. С переносом веществ через мембраны связаны процессы метаболизма клетки, биоэнергетические процессы, образование биопотенциалов, генерация нервного импульса и др. Нарушение транспорта веществ через биомембраны приводит к различным патологиям. Лечение часто связано с проникновением лекарств через клеточные мембраны.

Пассивный и активный транспорт веществ

Транспорт веществ через биологические мембраны можно разделить на два основных типа: пассивный и активный. Определения пассивного и активного транспорта связаны с понятием электрохимического потенциала. Известно, что движущей силой любого переноса является перепад энергии. Свободная энергия (энергия Гиббса) определяется при постоянном давлении, температуре и количестве переносимых частиц. Последнее обстоятельство удобно для описания переноса частиц вещества через мембрану с одной поверхности на другую.

Электрохимический потенциал - величина, численно равная энергии Гиббса на один моль данного вещества, помещенного в электрическое поле. Для разведенных растворов

где R = 8,31 Дж/(К " моль) - универсальная газовая постоянная, F = 96 500 Кл/моль (число Фарадея), Z - заряд иона электролита (в элементарных единицах заряда), j - потенциал электрического поля.

Пассивный транспорт идет в направлении перепада электрохимического потенциала вещества, происходит самопроизвольно и не требует свободной энергии АТФ.

Активный транспорт - это такой процесс, при котором перенос происходит из места с меньшим значением электрохимического потенциала к месту с большим его значением. Этот процесс, сопровождающийся ростом энергии, не может идти самопроизвольно, а только в сопряжении с процессом гидролиза АТФ, то есть за счет затраты энергии Гиббса, запасенной в макроэргических связях АТФ.

Плотность потока вещества jм - количество вещества в единицу времени через единицу площади - при пассивном транспорте подчиняется уравнению Теорелла

где U - подвижность частиц, С - концентрация. Знак минус показывает, что перенос происходит в сторону убывания.

Подставив в (2) выражение для электрохимического потенциала (1), получим для разбавленных растворов уравнение Нернста-Планка:

Итак, могут быть две причины переноса вещества при пассивном транспорте: градиент концентрации dC / dx и градиент электростатического потенциала dj / dx. В отдельных случаях вследствие сопряжения этих двух причин может происходить пассивный перенос вещества от мест с меньшей концентрацией к местам с большей концентрацией за счет энергии электрического поля.

В случае неэлектролитов (Z = 0) или постоянства электрического поля (dj / dx = 0) уравнение Теорелла переходит в уравнение

Согласно соотношению Эйнштейна, URT = D, где D - коэффициент диффузии, и, подставляя, получаем закон Фика

Виды пассивного транспорта

На рис. 1 представлены основные разновидности диффузии веществ через мембрану. Диффузия - самопроизвольное перемещение вещества из мест с большей их концентрацией в места с меньшей концентрацией вещества вследствие хаотического теплового движения частиц. Диффузия вещества через липидный бислой вызывается градиентом концентрации в мембране. Плотность потока вещества по закону Фика

где - концентрация вещества в мембране около одной ее поверхности и - около другой, l - толщина мембраны.

Так как измерить концентрации и трудно, на практике пользуются формулой, связывающей плотность потока вещества через мембрану с концентрациями этого вещества не внутри мембраны, а снаружи в растворах около поверхностей мембраны - С1 и С2:

jм = P (C1 - C2),

где Р - коэффициент проницаемости.

K - коэффициент распределения - показывает, какую часть концентрации у поверхности вне мембраны составляет концентрация у поверхности мембраны, но внутри ее.

Из уравнений (6) и (8) видно, что коэффициент проницаемости

Этот коэффициент удобен, поскольку имеет размерность линейной скорости (в м/с) и может быть определен по результатам измерения мембранных потенциалов.

Коэффициент проницаемости, как видно из формулы, тем больше, чем больше коэффициент диффузии D, чем тоньше мембрана и чем лучше вещество растворяется в липидной фазе мембраны (чем больше К). Хорошо растворимы в липидной фазе мембраны неполярные вещества, например: органические и жирные кислоты, эфиры. Естественно, эти вещества сравнительно легко проходят через клеточные мембраны, обладая повышенным сродством к липидной фазе мембран. В то же время плохо проходят через липидный бислой мембраны полярные вещества: вода, неорганические соли, сахара, аминокислоты. Так, величины Р для воды и мочевины равны соответственно 10 мкм/с и 1 пм/с. На первый взгляд представляется труднообъяснимым сравнительно большое значение Р для воды, полярного вещества, нерастворимого в липидах. Очевидно, что в этом случае речь может идти о переносе воды через наполненные водой белковые и липидные поры. Однако в последнее время помимо гидрофильных пор проникновение через мембрану мелких полярных молекул связывают с образованием между жирнокислотными хвостами фосфолипидных молекул при их тепловом движении небольших свободных полостей - кинков (от англ. kink - петля). Вследствие теплового движения хвостов молекул фосфолипидов кинки могут перемещаться поперек мембраны и переносить попавшие в них мелкие молекулы, в первую очередь молекулы воды.

Через гидрофильные липидные и белковые поры сквозь мембрану проникают молекулы нерастворимых в липидах веществ и водорастворимые гидратированные ионы, окруженные молекулами воды. Для жиронерастворимых веществ и ионов мембрана выступает как молекулярное сито: чем больше размер частицы, тем меньше проницаемость мембраны для этого вещества. Избирательность переноса обеспечивается набором в мембране пор определенного радиуса, соответствующих размеру проникающей частицы. Это распределение зависит от мембранного потенциала. Так, избирательные для ионов калия поры в мембране эритроцитов имеют сравнительно низкий коэффициент проницаемости, равный 4 пм/с при мембранном потенциале 80 мВ, который уменьшается в четыре раза с понижением потенциала до 40 мВ. Проницаемость мембраны аксона кальмара для ионов калия при уровне потенциала возбуждения определяется калиевыми каналами, радиус которых численно оценивается как сумма кристаллического радиуса иона калия и толщины одной гидратной оболочки (0,133 нм + 0,272 нм = 0,405 нм). Следует подчеркнуть, что селективность ионных каналов неабсолютна, каналы доступны и для других ионов, но с меньшими значениями Р.

Максимальная величина Р соответствует ионам калия. Ионы с большими кристаллическими радиусами (рубидий, цезий) имеют меньшие Р, по-видимому, потому, что их размеры с одной гидратной оболочкой превышают размер канала. Менее очевидна причина сравнительно низкого Р для ионов лития и натрия, имеющих меньший сравнительно с калием радиус. Исходя из представления о мембране как молекулярном сите можно было бы думать, что они должны свободно проходить через калиевые каналы. Одно из возможных решений этого противоречия предложено Л. Муллинзом. Он предполагает, что в растворе вне поры каждый ион имеет гидратную оболочку, состоящую из трех сферических слоев молекул воды. При вхождении в пору гидратированный ион "раздевается", теряя воду послойно. Пора будет проницаема для иона, если ее диаметр точно соответствует диаметру любой из этих сферических оболочек. Как правило, в поре ион остается с одной гидратной оболочкой. Расчет, приведенный выше, показывает, что радиус калиевой поры составит в этом случае 0,405 нм. Гидратированные ионы натрия и лития, размеры которых не кратны размерам поры, будут испытывать затруднение при прохождении через нее. Отмечено своеобразное "квантование" гидратированных ионов по их размерам при прохождении через поры.

Облегченная диффузия происходит при участии молекул переносчиков. Известно, например, что антибиотик валиномицин - переносчик ионов калия. Валиномицин является пептидом с молекулярной массой 1111. В липидной фазе молекула валиномицина имеет форму манжетки, устланной внутри полярными группами, а снаружи неполярными гидрофобными остатками молекул валина.

Особенности химического строения валиномицина позволяют образовывать комплекс с ионами калия, попадающими внутрь молекулы-манжетки, и в то же время валиномицин растворим в липидной фазе мембраны, так как снаружи его молекула неполярна. Ионы калия удерживаются внутри молекулы за счет сил ион-дипольного взаимодействия. Молекулы валиномицина, оказавшиеся у поверхности мембраны, могут захватывать из окружающего раствора ионы калия. Диффундируя в мембране, молекулы переносят калий через мембрану и отдают ионы в раствор по другую сторону мембраны. Таким образом и происходит челночный перенос ионов калия через мембрану.

Отличия облегченной диффузии от простой:

1) перенос ионов с участием переносчика происходит значительно быстрее по сравнению со свободной диффузией;

2) облегченная диффузия обладает свойством насыщения - при увеличении концентрации с одной стороны мембраны плотность потока вещества возрастает лишь до некоторого предела, когда все молекулы переносчика уже заняты;

3) при облегченной диффузии наблюдается конкуренция переносимых веществ в тех случаях, когда одним переносчиком переносятся разные вещества; при этом одни вещества переносятся лучше, чем другие, и добавление одних веществ затрудняет транспорт других;

4) есть вещества, блокирующие облегченную диффузию, они образуют прочный комплекс с молекулами переносчика, препятствуя дальнейшему переносу.

Разновидностью облегченной диффузии является транспорт с помощью неподвижных молекул переносчиков, фиксированных определенным образом поперек мембраны. При этом молекула переносимого вещества передается от одной молекулы переносчика к другой по типу эстафеты.

Осмос - преимущественное движение молекул воды через полупроницаемые мембраны (непроницаемые для растворенного вещества и проницаемые для воды) из мест с меньшей концентрацией растворенного вещества в места с большей концентрацией. Осмос, по сути, диффузия воды из мест с ее большей концентрацией в места с меньшей концентрацией. Осмос играет большую роль во многих биологических явлениях. Явление осмоса обусловливает гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах и тургор в растениях.

Активный транспорт веществ через биологические мембраны. Опыт Усинга

Активный транспорт веществ через биологические мембраны имеет огромное значение. За счет активного транспорта в организме создаются разности концентраций, разности электрических потенциалов, давления, поддерживающие жизненные процессы, то есть с точки зрения термодинамики активный перенос удерживает организм в неравновесном состоянии, поддерживает жизнь, так как равновесие - это смерть организма. Существование активного транспорта веществ через биологические мембраны впервые было доказано в опытах Усинга (1949 год) на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки. Опыт весьма поучителен и заслуживает подробного рассмотрения.

Экспериментальная камера Усинга, заполненная нормальным раствором Рингера, была разделена на две части свежеизолированной кожей лягушки. В опыте исследовали однонаправленные потоки ионов натрия через кожу лягушки в прямом и обратном направлениях.

Из уравнения, описывающего пассивный транспорт (2), следует уравнение Усинга-Теорелла для отношения этих потоков в случае пассивного транспорта

На изолированной коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов jвн - jнар (внутренняя сторона кожи положительна по отношению к наружной). В установке имелось специальное устройство: электрическая батарея с потенциометром - делителем напряжения, с помощью которых компенсировалась разность потенциалов на коже лягушки: Dj = jвн - jнар = 0, что контролировалось вольтметром. Кроме того, концентрация ионов натрия с внешней и внутренней сторон поддерживалась одинаковой. При этих условиях, как видно из уравнения Усинга-Теорелла,

jм, вн = jм, нар.

Суммарный поток ионов через мембрану должен был бы отсутствовать. Его наличие свидетельствовало бы о переносе ионов против перепада концентрации, то есть об активном переносе. Для доказательства этого в левую часть экспериментальной камеры были добавлены радиоактивные изотопы 22Na, а в правую - 24Na. 22Na распадается с излучением жестких g-квантов, излучение 24Na фиксировалось по мягким b-лучам. Было показано, что поток 22Na больше потока 24Na. О наличии тока в цепи свидетельствовали и показания миллиамперметра.

Эти экспериментальные данные неопровержимо свидетельствовали о том, что перенос ионов натрия через кожу лягушки не подчиняется уравнению пассивного транспорта. Более того, оказалось, что суммарный поток ионов натрия исключительно чувствителен к факторам, влияющим на энергетический обмен в клетках кожи: наличию кислорода, действию разобщителей окислительного фосфорилирования, действию низких температур. Следовательно, речь должна идти об особом способе переноса ионов, названном впоследствии активным. Позднее было установлено, что активный перенос ионов натрия в коже лягушки обеспечивается ионными насосами, локализованными в клетках базального эпителия. Работа насоса блокировалась специфическим ингибитором оуабаином.

Дальнейшие исследования показали, что в биологических мембранах имеется несколько разновидностей ионных насосов, работающих за счет свободной энергии гидролиза АТФ, - специальные системы интегральных белков (транспортные АТФазы). В настоящее время известны три типа электрогенных ионных насосов. Перенос ионов транспортными АТФазами происходит вследствие сопряжения процессов переноса с химическими реакциями за счет энергии метаболизма клеток.

При работе K+-Na+-АТФазы за счет энергии макроэргических связей, освобождающейся при гидролизе каждой молекулы АТФ, в клетку переносятся два иона калия и одновременно из клетки выкачиваются три иона натрия. Таким образом, создаются повышенная по сравнению с межклеточной средой концентрация в клетке ионов калия и пониженная концентрация ионов натрия, что имеет огромное физиологическое значение. Са-АТФаза обеспечивает активный перенос двух ионов кальция, протонная помпа - двух протонов на одну молекулу АТФ.

Молекулярный механизм работы ионных АТФаз до конца не изучен. Тем не менее прослеживаются основные этапы этого сложного ферментативного процесса. В случае К-Na-АТФазы (обозначим ее для краткости Е) насчитываются семь этапов переноса ионов, сопряженных с гидролизом АТФ. Обозначения Е1 и Е2 соответствуют расположению активного центра фермента на внутренней и внешней поверхности мембраны соответственно (аденозиндифосфат - АДФ, неорганический фосфат - P, звездочкой обозначен активный комплекс):

1) E + АТФ E*АТФ,

2) E*АТФ + 3Na *Na3 ,

3) *Na3 [Е1 ~ P]*Na3 + АДФ,

4) [Е1 ~ P]*Na3 [Е2 ~ P]*Na3 ,

5) [Е2 ~ P]*Na3 + 2K [Е2 - P]*K2 + 3Na,

6) [Е2 - P]*K2 [Е1 - P]*K2 ,

7) [Е1 - P]* E + P + 2K.

На схеме видно, что ключевыми этапами работы фермента являются: 1) образование комплекса фермента с АТФ на внутренней поверхности мембраны (эта реакция активируется ионами магния); 2) связывание комплексом трех ионов натрия; 3) фосфорилирование фермента с образованием аденозиндифосфата; 4) переворот (флип-флоп) фермента внутри мембраны;5) реакция ионного обмена натрия на калий, происходящая на внешней поверхности мембраны; 6) обратный переворот ферментного комплекса с переносом ионов калия внутрь клетки и 7) возвращение фермента в исходное состояние с освобождением ионов калия и неорганического фосфата (Р). Таким образом, за полный цикл происходят выброс из клетки трех ионов натрия, обогащение цитоплазмы двумя ионами калия и гидролиз одной молекулы АТФ.

Вторичный активный транспорт ионов

Помимо ионных насосов, рассмотренных выше, известны сходные системы, в которых накопление веществ сопряжено не с гидролизом АТФ, а с работой окислительно-восстановительных ферментов или фотосинтезом. Транспорт веществ в этом случае является вторичным, опосредованным мембранным потенциалом и/или градиентом концентрации ионов при наличии в мембране специфических переносчиков. Такой механизм переноса получил название вторичного активного транспорта. Наиболее детально этот механизм рассмотрен Питером Митчелом (1966 год) в хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования. В плазматических и субклеточных мембранах живых клеток возможно одновременное функционирование первичного и вторичного активного транспорта. Примером может служить внутренняя мембрана митохондрий. Ингибирование АТФазы в ней не лишает частицу способности накапливать вещества за счет вторичного активного транспорта. Такой способ накопления особенно важен для тех метаболитов, насосы для которых отсутствуют (сахара, аминокислоты).

В настоящее время достаточно глубоко исследованы три схемы вторичного активного транспорта. Для простоты рассмотрен транспорт одновалентных ионов с участием молекул-переносчиков. При этом подразумевается, что переносчик в нагруженном или ненагруженном состоянии одинаково хорошо пересекает мембрану. Источником энергии служит мембранный потенциал и/или градиент концентрации одного из ионов. Схемы показаны на рис. 5. Однонаправленный перенос иона в комплексе со специфическим переносчиком получил название унипорта. При этом через мембрану переносится заряд либо комплексом, если молекула переносчика электронейтральна, либо пустым переносчиком, если перенос обеспечивается заряженным переносчиком. Результатом переноса будет накопление ионов за счет снижения мембранного потенциала. Такой эффект наблюдается при накоплении ионов калия в присутствии валиномицина в энергизованных митохондриях.

Встречный перенос ионов с участием одноместной молекулы-переносчика получил название антипорта. Предполагается при этом, что молекула-переносчик образует прочный комплекс с каждым из переносимых ионов. Перенос осуществляется в два этапа: сначала один ион пересекает мембрану слева направо, затем второй ион - в обратном направлении. Мембранный потенциал при этом не меняется.Что же является движущей силой этого процесса? Очевидно, разность концентраций одного из переносимых ионов. Если исходно разность концентрации второго иона отсутствовала, то результатом переноса станет накопление второго иона за счет уменьшения разности концентраций первого. Классическим примером антипорта служит перенос через клеточную мембрану ионов калия и водорода с участием молекулы антибиотика нигерицина.

Совместный однонаправленный перенос ионов с участием двухместного переносчика называется симпортом. Предполагается, что в мембране могут находиться две электронейтральные частицы: переносчик в комплексе с катионом и анионом и пустой переносчик. Поскольку мембранный потенциал в такой схеме переноса не изменяется, то причиной переноса может быть разность концентраций одного из ионов. Считается, что по схеме симпорта осуществляется накопление клетками аминокислот. Калий-натриевый насос создает начальный градиент концентрации ионов натрия, которые затем по схеме симпорта способствуют накоплению аминокислот. Из схемы симпорта следует, что этот процесс должен сопровождаться значительным смещением осмотического равновесия, поскольку в одном цикле через мембрану переносятся две частицы в одном направлении.

В процессе жизнедеятельности границы клетки пересекают разнообразные вещества, потоки которых эффективно регулируются. С этой задачей справляется клеточная мембрана с встроенными в нее транспортными системами, включающими ионные насосы, систему молекул-переносчиков и высокоселективные ионные каналы.

Такое обилие систем переноса на первый взгляд кажется излишним, ведь работа только ионных насосов позволяет обеспечить характерные особенности биологического транспорта: высокую избирательность, перенос веществ против сил диффузии и электрического поля. Парадокс заключается, однако, в том, что количество потоков, подлежащих регулированию, бесконечно велико, в то время как насосов всего три. В этом случае особое значение приобретают механизмы ионного сопряжения, получившие название вторичного активного транспорта, в которых важную роль играют диффузионные процессы. Таким образом, сочетание активного транспорта веществ с явлениями диффузионного переноса в клеточной мембране - та основа, которая обеспечивает жизнедеятельность клетки.

И ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН

С точки зрения проницаемости липидные поры принципиально отличаются от белковых каналов своим происхождением и исключительной динамичностью. В то время как белковые каналы имеют строго определенные размеры, сохраняющиеся в течение всей жизни клетки, размеры липидных пор в процессе затекания варьируют в широких пределах. Однако эта изменчивость имеет предел. Если радиус поры меньше критического, то пора в процессе затекания должна пройти все промежуточные радиусы и достигнуть минимального размера. Вопрос о возможности полного затекания липидных пор остается открытым. Предполагается, что полному затягиванию поры препятствуют мощные силы гидратации, проявляющиеся при сближении стенок гидрофильных пор.

Липидные поры в отличие от белковых ионных каналов не обладают выраженной избирательностью, что коррелирует с их сравнительно большими исходными размерами. Ясно, однако, что в процессе затекания липидные поры могут достигать сколь угодно малых размеров, в том числе сравнимых с размерами белковых ионных каналов, что может приводить к перераспределению ионных токов в мембране, например при возбуждении. Известно далее, что после выключения стрессового воздействия бислойная липидная мембрана может вернуться в состояние с низкой проводимостью, что подразумевает достижение порами размера, недостаточного для прохождения гидратированных ионов. Таким образом, гидрофильные липидные поры универсальны в том отношении, что могут быть использованы клеткой для транспорта высокомолекулярных веществ, ионов и молекул воды.

Исследования проницаемости липидных пор развиваются в настоящее время в двух направлениях: в первом исследуются максимально большие поры, во втором, наоборот, - липидные поры минимального радиуса. В первом случае речь идет об электротрансфекции - способе введения в живые клетки или липосомы молекул ДНК с целью переноса и внутриклеточного введения чужеродного генетического материала. Оказалось, что внешнее электрическое поле высокой напряженности способствует проникновению гигантской молекулы ДНК внутрь мембранной частицы. Как видно из, максимальный размер критической поры соответствует жидкокристаллическому состоянию бислоя липидов при отсутствии внешнего электрического поля и равен 9 нм. Наложение внешнего электрического поля напряженностью 100 кВ/м понижает критический радиус поры до 1 нм за время 0,2 с. Поскольку при этом мембраны сохраняются, то размер липидных пор в них не превышает, очевидно, этого нижнего предела. Парадокс состоит в том, что эффективный диаметр статистического клубка ДНК, которая должна попасть внутрь частицы, достигает 2000 нм. Поистине задача про верблюда, проникающего сквозь игольное ушко. Поэтому очевидно, что молекула ДНК должна проникать через мембрану в виде расплетенной одиночной нити. Известно, что конец нити имеет диаметр 2 нм и таким образом только-только может войти в пору. Однако свободная диффузия нити ДНК в поре при этом вряд ли возможна. К сожалению, механизм этого явления до конца неясен. Предполагается, в частности, что молекула ДНК способна расширить пору и таким образом проскользнуть через мембрану. Проникновению ДНК могут способствовать дополнительные силы электрофореза и электроосмоса с учетом суммарного отрицательного заряда молекулы ДНК. Не исключено, что поры с фиксированными в них концами молекулы ДНК играют роль якоря, удерживающего молекулу в определенном месте у поверхности мембраны везикулы, а сам процесс переноса является разновидностью пиноцитоза. Исследование этого интересного с точки зрения

Иногда необходимо, чтобы внутри клетки концентрация вещества была высокой даже при низкой концентрации его во внеклеточной жидкости (например, для ионов калия). И наоборот, концентрацию других ионов внутри клетки важно сохранять на низком уровне, несмотря на их высокие концентрации вне клетки (например, для ионов натрия). Ни в одном из этих двух случаев это не может обеспечиваться простой диффузией, итогом которой всегда является уравновешивание концентрации ионов по обе стороны мембраны. Для создания избыточного движения ионов калия внутрь клетки, а ионов натрия - наружу необходим некий источник энергии. Процесс перемещения молекул или ионов через клеточную мембрану против градиента концентрации (или против электрического градиента, а также градиента давления) называют активным транспортом.

К веществам, активно транспортируемым , по крайней мере, через некоторые клеточные мембраны, относят ионы натрия, калия, кальция, железа, водорода, хлора, йода, мочевой кислоты, некоторые сахара и большинство аминокислот.

Первично активный и вторично активный транспорт . В зависимости от источника используемой энергии активный транспорт подразделяется на два типа: первично активный и вторично активный. Для первично активного транспорта энергия извлекается непосредственно при расщеплении аденозинтрифосфата или некоторых других высокоэнергетических фосфатных соединений. Вторично активный транспорт обеспечивается вторичной энергией, накопленной в форме разности концентраций побочных веществ, молекул или ионов, по обе стороны клеточной мембраны, созданной первоначально первично активным транспортом. В обоих случаях, как и при облегченной диффузии, транспорт зависит от белков-переносчиков, пронизывающих клеточную мембрану. Однако функции белков-переносчиков при активном транспорте отличаются от переноса облегченной диффузией, поскольку в первом случае белки способны передавать энергию транспортируемому веществу для его перемещения против электрохимического градиента. Далее приведены примеры первично активного и вторично активного транспорта с более детальными объяснениями принципов их функционирования.

Натрий-калиевый насос

К веществам , которые транспортируются посредством первично активного транспорта, относят натрий, калий, кальций, водород, хлор и некоторые другие ионы.
Механизм активного транспорта лучше всего изучен для натрий-калиевого насоса (Na+/K+-нaсоса) - транспортного процесса, который выкачивает ионы натрия через мембрану клетки наружу и в то же время закачивает в клетку ионы калия. Этот насос отвечает за поддержание различной концентрации ионов натрия и калия по обе стороны мембраны, а также за наличие отрицательного электрического потенциала внутри клеток. (В главе 5 будет показано, что он является также основой процесса передачи импульсов в нервной системе.)

Белок-переносчик представлен комплексом из двух раздельных глобулярных белков: более крупного, называемого альфа-субъединицей, с молекулярной массой около 100000, и меньшего, называемого бета-субъединицей, с молекулярной массой около 55000. Хотя функция меньшего белка неизвестна (за исключением того, что он, возможно, закрепляет белковый комплекс в липидной мембране), крупный белок имеет три специфических характеристики, важные для функционирования насоса.

1. На выступающей внутрь клетки части белка имеются три рецепторных участка для связывания ионов натрия.
2. На наружной части белка располагаются два рецепторных участка для связывания ионов калия.
3. Внутренняя часть белка, расположенная вблизи участков связывания ионов натрия, обладает АТФ-азной активностью.

Рассмотрим работу насоса . Когда 2 иона калия связываются с белком-переносчиком снаружи и 3 иона натрия связываются с ним внутри, активируется АТФ-азная функция белка. Это ведет к расщеплению 1 молекулы АТФ до АДФ с выделением энергии высокоэнергетической фосфатной связи. Полагают, что эта освобожденная энергия вызывает химическое и конформационное изменение молекулы белка-переносчика, в результате 3 иона натрия перемещаются наружу, а 2 иона калия - внутрь клетки.

Как и другие ферменты, Na-K+-ATФ-aзa может работать и в обратном направлении. При экспериментальном увеличении электрохимических градиентов для Na+ и К+ до таких значений, что накопленная в них энергия станет выше химической энергии гидролиза АТФ, эти ионы будут двигаться по своим градиентам концентрации, а Na+/K+-Hacoc будет синтезировать АТФ из АДФ и фосфата. Следовательно, фосфорилированная форма Nа+/К+-насоса может быть или донором фосфатов для синтеза АТФ из АДФ, или использовать энергию для изменения своей конформации и качать натрий из клетки, а калий - в клетку. Относительные концентрации АТФ, АДФ и фосфатов, как и электрохимические градиенты для натрия и калия, определяют направление ферментативной реакции. Для некоторых клеток, например электрически активных нервных клеток, от 60 до 70% всей потребляемой клеткой энергии тратится на перемещение натрия наружу и калия внутрь.

Через мембрану должны проходить молекулы разных веществ. Они могут быть растворимыми в воде (гидрофильными) или в жи­рах (гидрофобными), заряженными (ионы К + , Na + , NO - 3 , Са 2+) или незаряженными (СО 2 , О 2 , Н 2 О, аминокислоты, сахара), большими (белки, полисахариды) или маленькими.

Поскольку внутренняя часть липидного бислоя мембраны - гидрофобна, она представляет собой практически непроницаемый барьер для большинства полярных молекул. Благодаря такому барьеру вещества, растворимые в воде, не могут выйти из клетки. Однако клетка должна получать необходимые питательные вещест­ва и освобождаться от ненужных.

Трудности транспорта веществ через мембраны связаны еще с тем, что многие элементы минерального питания клетка поглощает в ионной форме, а мембраны имеют электрический заряд. Напри­мер, внутренняя сторона плазмалеммы заряжена отрицательно по отношению к наружному раствору. Это помогает прохождению в протопласт положительно заряженных ионов и препятствует посту­плению отрицательно заряженных. Тонопласт, наоборот, имеет по­ложительный заряд.

Если транспортируемая молекула не заряжена, то направление ее движения определяется только разностью концентраций этого вещества по обеим сторонам мембраны (градиентом концентра­ции): молекулы передвигаются в сторону их меньшей концентра­ции. Однако если молекула заряжена, то на ее транспорт влияет и разница электрических потенциалов на сторонах мембраны (элек­трический градиент). Вместе концентрационный и электрический градиенты составляют электрохимический градиент.

Кроме того, ионы окружены водной оболочкой, увеличивающей их диаметр. Так, например, радиус негидратированного иона калия составляет 0,133 нм, а притяжение водных молекул увеличивает его до 0,34 нм. В результате для всех ионов, независимо от их разме­ров, мембраны оказываются в значительной степени непроницае­мыми.

Часто концентрация веществ в клетке больше, чем в свободном пространстве, поэтому вещество должно двигаться против электро­химического градиента. Для такого транспорта нужна энергия. Транспорт веществ через мембрану без затраты энергии, по градиенту электрохимического потенциала называется пассив­ным, а транспорт, идущий против электрохимического потенциала с затратой энергии, вьделяющейся в процессе метаболизма (АТФ), - активным.

Диффузия - пассивный транспорт, она происходит по градиенту электрохимического потенциала без траты энергии. Малые неполярные молекулы, такие как кислород, легко рас­творяются в липидных бислоях и поэтому быстро проходят через мембрану. Незаряженные полярные молекулы также диффундиру­ют с большой скоростью, если они достаточно малы, например углекислый газ (44 Да), этанол (46 Да), мочевина (60 Да). Они про­скакивают через отверстия, которые образуются между колеблю­щимися «хвостами» липидных молекул.

Чтобы диффузия шла долго и увеличение кон­центрации вещества в клетке не остановило ее, молекула вошедшего в цитоплазму вещества должна так измениться с помо­щью химической реакции, чтобы мембрана стала для нее непрони­цаемой. Например, в клетках некоторых бактерий сахара после пе­реноса через плазматическую мембрану фосфорилируются. В результате они становятся заряженными, не могут выйти из клетки и накапливаются в ней.

Маленькие водорастворимые молекулы (сахара, аминокислоты, нуклеотиды) через гидрофобный бислой мембраны переносят спе­циальные белки, которые называют мембранными транспортными белками. Каждый белок переносит только определенную молекулу или гpyппу похожих молекул, т. е. эти белки относительно специ­фичны. Таким способом обеспечивается избирательность поглоще­ния веществ клеткой.

Существуют два типа мембранных транспортных белков - бел­ ки-переносчики и каналообразующие белки.

Белки-переносчики .- Работа белков-переносчиков напоминает работу фермента, но переносимое вещество при этом не изменяет­ся. Транс­портный белок соединяется с молекулой или ионом переносимого вещества по принципу комплементарности (пространственное соответствие поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящее к образованию между ними вто­ричных связей (водородных, ионных и др.)).

Белки-переносчики транспортируют вещества через мембраны как по градиенту электрохимического потенциала, так и против этого градиента. Транспорт растворенных веществ через мембрану по градиенту электрохимического потенциала с помощью перенос­чика называется облегченной диффузией.

Специальные белки, находящиеся в мембране и транс­портирующие через нее растворенные вещества против градиента электрохимического потенциала с использованием энергии, осво­бождаемой, например, при гидролизе АТФ, получили название ионных насосов.

Перенос транспортными белками одного вещества через мем­брану называют унипортом, а одновременный перенос двух ве­ществ - котранспортом. Если два вещества транспортируются че­рез мембрану одновременно в одном направлении, то такой транс­порт называется симпортом, если в разных направлениях, то - ан­ типортом

Каналообразующие белки образуют в мембранах ка­налы, пронизывающие липидный бислой и заполненные водой. Наружная поверхность этих каналов гидрофобна, а внутренняя - гидрофильна; диаметр канала - 0,5-0,8 нм. Веще­ства проходят через каналы, не контактируя с гидрофобной частью мембраны. Практически все каналы служат для транспорта ионов, поэтому их называют ионными каналами . Внастоящее время известно около 50 видов этих каналов. Наиболее распространенными явля­ются каналы, проницаемые для ионов калия, кальция. Ионные каналы могут открываться и закрываться.

Транспортные белки переносят через мембраны полярные мо­лекулы небольшого размера. Для транспорта крупных молекул, на­пример белков, полинуклеотидов, полисахаридов, существуют дру­гие механизмы - эндоцитоз и экзоцитоз.

Вещество сначала адсорбируется на мембране, этот небольшой уча­сток мембраны впячивается (инвагинируется) и окружает погло­щаемое вещество, образуя транспортный пузырек, или везикулу. В зависимости от размера образующихся пузырьков различают два типа эндоцитоза: пиноцитоз и фагоцитоз. Пиноцитозом назы­вается поглощение жидкости и растворенных веществ с помощью маленьких пузырьков (150 нм в диаметре). Фагоцитоз - это погло­щение больших частиц, таких как микроорганизмы или части раз­рушенных клеток; в этом случае образуются крупные пузырьки, называемые фагосомами.

Не только белки переносят вещества через мембраны. Эту роль могут выполнять небольшие гидрофобные молекулы, которые рас­творяются в липидных бислоях- ионофоры. Ионофоры не связаны ни с какими источниками энергии, по­этому с их помощью ионы передвигаются только пассивно, по гра­диентам электрохимических потенциалов.

Транспорт веществ внутрь и наружу клетки, а также между цитоплазмой и различными субклеточными органеллами (митохондриями, ядром и т.д.) обеспечивается мембранами. Если бы мембраны были глухим барьером, то внутриклеточное пространство оказалось бы недоступным для питательных веществ, а продукты жизнедеятельности не могли бы быть удалены из клетки. В то же время при полной проницаемости было бы невозможно накопление определенных веществ в клетке. Транспортные свойства мембраны характеризуются полупроницаемостью : некоторые соединения могут проникать через нее, а другие - нет:

Проницаемость мембран для различных веществ

Одна из главных функций мембран - регуляция переноса веществ. Существуют два способа переноса веществ через мембрану: пассивный и активный транспорт:

Транспорт веществ через мембраны

Пассивный транспорт . Если вещество движется через мембрану из области с высокой концентрацией в сторону низкой концентрации (т.е. по градиенту концентрации этого вещества) без затраты клеткой энергии, то такой транспорт называется пассивным, или диффузией . Различают два типа диффузии: простую и облегченную .

Простая диффузия характерна для небольших нейтральных молекул (H 2 O, CO 2 , O 2), а также гидрофобных низкомолекулярных органических веществ. Эти молекулы могут проходить без какого-либо взаимодействия с мембранными белками через поры или каналы мембраны до тех пор, пока будет сохраняться градиент концентрации.

Облегченная диффузия . Характерна для гидрофильных молекул, которые переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных мембранных белков - переносчиков. Для облегченной диффузии, в отличие от простой, характерна высокая избирательность, так как белок переносчик имеет центр связывания комплементарный транспортируемому веществу, и перенос сопровождается конформационными изменениями белка. Один из возможных механизмов облегченной диффузии может быть следующим: транспортный белок (транслоказа ) связывает вещество, затем сближается с противоположной стороной мембраны, освобождает это вещество, принимает исходную конформацию и вновь готов выполнять транспортную функцию. Мало известно о том, как осуществляется передвижение самого белка. Другой возможный механизм переноса предполагает участие нескольких белков-переносчиков. В этом случае первоначально связанное соединение само переходит от одного белка к другому, последовательно связываясь то с одним, то с другим белком, пока не окажется на противоположной стороне мембраны.

Активный транспорт имеет место в том случае, когда перенос осуществляется против градиента концентрации. Такой перенос требует затраты энергии клеткой. Активный транспорт служит для накопления веществ внутри клетки. Источником энергии часто является АТР. Для активного транспорта кроме источника энергии необходимо участие мембранных белков. Одна из активных транспортных систем в клетке животных отвечает за перенос ионов Na + и K + через клеточную мембрану. Эта система называется Na + - K + - насос. Она отвечает за поддержание состава внутриклеточной среды, в которой концентрация К + выше, чем Na + :

Механизм действия Na + , K + -АТР-азы

Градиент концентрации калия и натрия поддерживается путем переноса К + внутрь клетки, а Na + наружу. Оба транспорта происходят против градиента концентрации. Такое распределение ионов определяет содержание воды в клетках, возбудимость нервных клеток и клеток мышц и другие свойства нормальных клеток. Na + ,K + -насос представляет собой белок - транспортную АТР-азу . Молекула этого фермента является олигомером и пронизывает мембрану. За полный цикл работы насоса из клетки в межклеточное вещество переносится три иона Na + , а в обратном направлении - два иона К + . При этом используется энергия молекулы АТР. Существуют транспортные системы для переноса ионов кальция (Са 2+ - АТР-азы), протонные насосы (Н + - АТР-азы) и др. Симпорт это активный перенос вещества через мембрану, осуществляемый за счет энергии градиента концентрации другого вещества. Транспортная АТР-аза в этом случае имеет центры связывания для обоих веществ. Антипорт - это перемещение вещества против градиента своей концентрации. При этом другое вещество движется в противоположном направлении по градиенту своей концентрации. Симпорт и антипорт могут происходить при всасывании аминокислот из кишечника и реабсорбции глюкозы из первичной мочи. При этом используется энергия градиента концентрации ионов Na + , создаваемого Na + , K + -АТР-азой.

К мембранным белкам относятся белки, которые встроены в клеточную мембрану или мембрану клеточной органеллы или ассоциированы с таковой. Около 25 % всех белков являются мембранными.